テクニカルインフォメーション

ペプチド・タンパク質の分離

ペプチドやタンパク質を分析する際は目的によって適切な分離モード・カラムを選択します。高分離が必要な場合にはイオン交換や逆相HPLCが用いられます。逆相HPLCでは、分子量10万程度までのタンパク質の分離が可能ですが、抗体など10万以上のタンパク質の分離にはイオン交換が適しています。
サイズ排除は分子量によって分離するため、分子量分布などの情報を得ることもできます。

ペプチドマッピングの分離モードによる比較

BSA(MW 66,000)のトリプシン消化物を3種類の分離モードで分離しています。サイズ排除のクロマトグラムから、この試料中には、分子量が100前後から20,000程度のものまで幅広い分子量のフラグメントが存在していることが分かります。一方、イオン交換や逆相は、各成分の構造の違いによる分離能に優れ、非常に多くのピークが検出できています。

イオン交換

YMC-BioPro QA 5μm, 50 X 4.6 mmI.D.

Eluent A) 20 mM Tris-HCl (pH 8.6)
B) 20 mM Tris-HCl (pH 8.6) containing 0.5 M NaCl
0-15%B (0-30 min), 15-60%B (30-60 min)
Flow rate 0.5 mL/min
Temperature 25ºC
Detection UV at 220 nm
Injection 20 µL

サイズ排除

YMC-Pack Diol-120+Diol-60 5μm, 500 X 8.0 mmI.D. X 2

タンパク質・ペプチド較正曲線
1. Myoglobin    (MW 17,000)
2. Insulin (Bovine)   (MW 5,700)
3. Neurotensin   (MW 1,672)
4. Tetraglycine   (MW 246)
5. Glycine     (MW 75)

Eluent 0.1 M KH2PO4-K2HPO4 (pH 7.0)
containing 0.2 M NaCl/acetonitrile (70/30)
Flow rate 0.7 mL/min
Temperature ambient (25ºC)
Detection UV at 220 nm
Injection 5 µL

逆相

YMCbasic 5μm, 150 X 2.0 mmI.D.

Eluent A) water/THF (100/0.1)
B) acetonitril/TFA (100/0.1)
5-35%B (0-50 min), 35-45%B (50-55 min), 45%B (55-60 min)
Flow rate 0.2 mL/min
Temperature 37ºC
Detection UV at 220 nm
Injection 1 µL

ペプチド・タンパク質分離における逆相カラム選択の目安

タンパク質およびペプチドを分離する際、分離対象化合物の分子量を目安にカラムの選定を行います。
Triart C18は、高温条件での使用により分子量3万までのペプチド・タンパク質の分離が可能です。また、分子量10万程度までのタンパク質にはC4, 30 nmが適したカラムになります。
分子量のほかに化合物の疎水性の大きさ、官能基の種類などが分離に影響をおよぼすこともありますので、ファーストチョイスのカラムで目的の分離が得られない場合は細孔径を変更したり、官能基を変更して最適化を行ってください。C18, C8, C4のほかに選択性の異なるPROTEIN-RPおよびCNタイプなどもあります。核酸、オリゴヌクレオチドなどを分離する場合もタンパク質、ペプチドに準じて分子量に応じたカラムを選択します。