化学合成で製造可能なオリゴヌクレオチドを薬効本体とする核酸医薬品の可能性が再認識され、研究開発が活発化しています。その中で、核酸医薬品合成後の類縁体の分析や分離精製が重要な課題となっています。
ここではノンポーラスタイプのイオン交換カラムBioPro IEX QFを用いたオリゴヌクレオチドの分析時のポイントを紹介します。
| 一本鎖DNA | 5’-TCATCACACTGAATACCAAT-3’ (DNA 20 mer) |
| 5’-GTCATCACACTGAATACCAAT-3’ (DNA 21 mer) | |
| 一本鎖RNA | 5’-U(M)C(M)A(M)U(M)C(M)A(M)C(M)A(M)C(M)U(M)G(M)A(M)A(M)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-3’ (2’-OMe RNA 20 mer) |
| 5’-G(M)U(M)C(M)A(M)U(M)C(M)A(M)C(M)A(M)C(M)U(M)G(M)A(M)A(M)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-3’ (2’-OMe RNA 21 mer) |
|
| 5’-UCAUCACACUGAAUACCAAU-3’ (RNA 20 mer) | |
| 5’-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-3’ (RNA 21 mer) |
N(M)=2’-OMe RNA
グラジエント初期のNaCl濃度が低い場合はキャリーオーバーが認められますが、 グラジエント初期のNaCl濃度を高く（300-400 mM NaClなど）することで、 キャリーオーバーのない再現性の良いクロマトグラムが得られます。
A) 20 mM Tris-HCl (pH8.1)
B) 20 mM Tris-HCl (pH8.1) containing 1.0 M NaCl
5-70%B (0-15 min), 74%B (15-18 min), 5%B (18-33 min)
グラジエント初期：50 mM NaCl
A) 20 mM Tris-HCl (pH8.1)
B) 20 mM Tris-HCl (pH8.1) containing 1.0 M NaCl
40-70%B (0-15 min), 74%B (15-18 min), 40%B (18-33 min)
グラジエント初期：400 mM NaCl
| 共通条件 | |
| Column | BioPro IEX QF, 5 µm, 100 X 4.6 mmI.D. |
|---|---|
| Flow rate | 1.0 mL/min |
| Temperature | 25°C |
| Detection | UV at 260 nm |
| Injection | 2 µL (10 nmol/mL) |
緩衝液は、20 mM Tris-HCl (pH8.1)より10 mM NaOHにて、オリゴヌクレオチドのピーク形状が良好です。また、カウンターイオンとして使用する塩は、NaCl よりNaClO4を用いる方がピークテイリングが抑えられています。
→オリゴヌクレオチド分析で良好なピーク形状を得るためには、緩衝液の種類、塩の種類を最適化することが有効です。
1) 緩衝液の種類の影響
| Eluent | A) X B) X containing 2.0 M NaCl 15-100%B (0-30 min) |
|---|
2) 塩の種類の影響
| Eluent | A) 10 mM NaOH B) 10 mM NaOH containing 2.0 M Y 15-100%B (0-30 min) for NaCl 5-50%B (0-30 min) for NaClO4 |
|---|
イオン交換において、NaClO4を用いる場合は溶出力が2-3倍大きくなるため、移動相条件のグラジエント比率を調整しています。
| 共通条件 | |
| Column | BioPro IEX QF, 5 µm, 100 X 4.6 mmI.D. |
|---|---|
| Flow rate | 1.0 mL/min |
| Temperature | 25°C |
| Detection | UV at 260 nm |
| Injection | 2 µL (10 nmol/mL) |
| Sample | RNA 20 mer |
オリゴヌクレオチドの分析について、ノンポーラスタイプのイオン交換カラムであるBioPro IEX QFを用いて、移動相の緩衝液の種類、塩の種類、グラジエント条件を最適化することにより、キャリーオーバー、テイリングなく溶出する分析条件を見出すことができました。
一本鎖 DNA
一本鎖 2'-OMe RNA
一本鎖 RNA
| Column | BioPro IEX QF 5 µm, 100 X 4.6 mm.I.D. |
|---|---|
| Eluent | A) 10 mM NaOH B) 10 mM NaOH containing 1.0 M NaClO4 25-55%B (0-15 min), 100%B (15-20 min) |
| Flow rate | 1.0 mL/min |
| Temperature | 25°C |
| Detection | UV at 260 nm |
| Injection | 4 µL (各5 nmol/mL) |
