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オリゴ核酸を薬効本体とする核酸医薬品は、低分子医薬品や抗体医薬品では難しい細胞内分子を標的にすることが可能です。また、低分子医薬品のように化学合成で製造できるため、抗体医薬品と比較して低コストで製造可能です。これらのことから、核酸医薬品の開発が活発化しています。
現在開発されているほとんどの核酸医薬品は、核酸分解酵素ヌクレアーゼに対する耐性獲得や細胞送達性改善のため、ホスホロチオエート化（S化）などの修飾が施されています。
ここでは、ホスホロチオエート型オリゴ核酸のイオンペア逆相分析についてご紹介します。
オリゴ核酸は、トリエチルアミン（TEA）やN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）のように、分子内に正の解離基と疎水性官能基を有するイオンペア試薬を用い、負に解離したオリゴヌクレオチドと電荷として中性のイオンペアを形成させ、逆相充填剤で分離します。
イオンペア試薬の他、移動相のpHを調整するための酸性モディファイアも添加されますが、LC-MS分析の感度向上や分離改善の面でメリットがある、ヘキサフルオロ-2-プロパノール（HFIP）が分析のシーンではよく用いられています。
TEA-HFIPの組み合わせはアセトニトリルと混和性が低いため、有機溶媒にはメタノールが使用されます。
逆相イオンペアHPLCでのオリゴ核酸分析においては、固定相（カラム）、移動相（イオンペア試薬および酸モディファイア濃度・種類）、カラム温度などが分離やピーク形状に大きく影響します。
［移動相］
［カラム］
［その他］
TEA-HFIP移動相を用いた20、21merのホスホロチオエート型（S化）オリゴ核酸分析において、TEAとHFIPの濃度を変えて検討しています。TEA-HFIPの濃度が高濃度なほど分離が良好で、ピークがシャープになっています。
ホスホロチオエート型RNA（RNA All PS）
| Column | YMC-Triart Bio C18 (1.9 µm, 30 nm) 50 X 2.1 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | A) クロマトグラム参照 B) methanol 8-18%B (0-10 min) |
| Flow rate | 0.42 mL/min |
| Temperature | 65°C |
| Detection | UV at 260 nm |
20、21merのS化オリゴ核酸の分離について、温度を変えて分析しています。
温度が高くなるにつれてピーク形状がシャープになっていますが、90℃ではピーク形状不良となっています。
オリゴ核酸の配列によって温度依存性は異なるため、適切な温度条件を確認する必要があります。
| Column | YMC-Triart Bio C18 (1.9 µm, 30 nm) 50 X 2.1 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | A) 15 mM TEA-400 mM HFIP B) methanol |
| Gradient slope | 1%B/min (initial %B=クロマトグラム参照) |
| Flow rate | 0.42 mL/min |
| Temperature | クロマトグラム参照 |
| Detection | UV at 260 nm |
オリゴ核酸に含まれるリン酸基は金属材料に吸着し、ピークのブロードニングやキャリーオーバーによる定量性・LC-MS感度低下の原因になります。バイオイナートカラムAccura Triartを使用すると、このような金属への吸着を抑制し、ステンレス製カラムに比べピーク高さが高く、高感度分析が可能です。
| Column | 1.9 µm, 30 nm 50 X 2.1 mmI.D. |
|---|---|
| Eluent | A) 15 mM TEA-400 mM HFIP B) methanol 8-18%B (0-10 min) |
| Flow rate | 0.42 mL/min |
| Temperature | 65°C |
| Detection | UV at 260 nm |
移動相の濃度や種類による分離への影響や、イオン交換モードでの分析例など、さらに詳細な資料をご用意しています。
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